Con el trabajo de varios años hemos ido conformando un grupo de trabajo enfocado en la biología de los glóbulos rojos (GR) y en cómo extender la vida útil de los concentrados de GR para transfusión, conformado por la Dra. Leonor Thomson, Profesora Agregada de Enzimología del Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias, el Dr. Ismael Rodríguez, Profesor Titular de la Cátedra y Departamento de Medicina Transfusional, la Dra. Ana Denicola, Profesora Titular de Fisicoquímica Biológica del Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias y el Dr. Matías Möller, Profesor Adjunto de Fisicoquímica Biológica del Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias. A continuación, se exponen los principales resultados de un proyecto culminado recientemente.
Estrategias para mejorar la manufactura, conservación y controles de calidad de los preparados de hemocomponentes para transfusión
La transfusión de glóbulos rojos y de otros hemoderivados son una herramienta de extremo valor para la práctica clínica. Sin embargo, las reacciones adversas a la transfusión de hemo componentes son una complicación relativamente frecuente. La presencia de leucocitos y de los mediadores solubles generados por estas células en la bolsa de transfusión ha sido señalada como responsable potencial de estos efectos deletéreos y de los cambios estructurales y metabólicos observados en los glóbulos rojos durante el almacenamiento. El empleo de técnicas de leuco-depleción en la Unión Europea y en parte de los Estados Unidos ha disminuido la incidencia de estas reacciones desfavorables. En nuestro país, de los 160.000 volúmenes de concentrados de glóbulos rojos trasfundidos al año, sólo un 15% se leucorreducen. Además, en Uruguay, este proceso se realiza sobre preparados almacenados por un tiempo variable, lo que lleva a la acumulación de mediadores inflamatorios y la aparición de un fenotipo senescente en los eritrocitos. Con el fin de colaborar en la instauración de políticas sanitarias tendientes a mejorar la provisión de esta importante herramienta terapéutica nos proponemos evaluar el efecto de la leucorreducción sobre los glóbulos rojos para transfusión, analizando índices moleculares y funcionales de daño celular y la actividad proinflamatoria del preparado. Este proyecto se origina a partir de la colaboración entre el director de la Cátedra de Medicina Transfusional del Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina e investigadores del Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias e involucra el desarrollo de cuatro tesis de posgrado en marcha.
Esquema representando el procesamiento inicial de las muestras de sangre mediante sistema cerrado. A. La sangre extraída se colocará en bolsas receptoras conteniendo solución anticoagulante (CPD). B. La bolsa se centrifuga para separar el plasma de los glóbulos rojos, que se transfieren a otra bolsa conteniendo SAGM. C. El 50% del contenido se pasará a través del filtro de leucorreducción. D. Tanto la bolsa sin leucorreducir (N) como la bolsa leucorreducida (L) se fraccionarán a bolsas pediátricas (5 por muestra) que se conservarán a 4º C hasta su uso, al día 0, 7, 14, 21 y 42.
Esquema mostrando el fraccionamiento de las muestras y su análisis posterior. El procesamiento de las bolsas leucorreducidas (L) y no leucorreducidas (N), del mismo donante Se fraccionarán en: Fracción 1, consistente en concentrado de glóbulos rojos (10 mL) que se separan para la realización de los Controles de Calidad. Los 30 mL remanentes se centrifugan a (800 g por 5 min a 4º C), para obtener: Fracción 2, el sobrenadante, que se divide en dos Fracciones: 2a, que se analizará como se describe en el punto 3 y Fracción 2b que se analizará, como se describe en el punto 5. Ambas se mantendrán congeladas a -80º C hasta su uso. Fracción 3, GR intactos (precipitado) se resuspenden en 30 mL (hematocrito aprox. 70%) en solución salina Hank’s (HBSS), que se emplearán para estudios de citometría y funcionalidad de membrana (permeabilidad). Fracción 4. GR congelados a -80º C para su análisis posterior. A partir de esta fracción se aislará la fracción de membrana (fantasmas).
Microscopia electrónica de barrido. Los GR fueron fijados en glutaraldehído (2,5%) y montados en portaobjetos de vidrio con poli-Lys. Luego de fijación con tetróxido de osmio (1%) y deshidratación con una serie graduada de etanol (50-70-90-100 %), los preparados se secan en punto crítico con CO2 líquido y se cubren con una capa de oro-paladio. La figura muestra la presencia predominante discos bicóncavos (a) típicos de GR normales y la aparición de algunas formas con espículas finas (b, equinocitos) y otras más gruesas (c, acantocitos) envejecidos (Bessis, 1972). La sangre empleada provino de un donante voluntario, almacenada por 21 días.
Análisis de fluidez de membranas. Suspensiones de GR (1 x 106 cel/L) almacenados por 21 (izquierda) y 32 días (derecha) se incubaron con la sonda fluorescente laurdan, se inmovilizaron sobre portaobjetos cubiertos con poli-Lys y se observaron con el microscopio confocal Zeiss LSM 800CyAn ™ ADP (Beckman Coulter), en el Instituto Pasteur Montevideo. Código de color: rojo, GP = 1 (gel, ordenado); azul, GP = -1 (liquido, desordenado). La figura muestra un cambio en tamno y y un aumento en la fluidez de la membrana con el almacenamiento.
Publicaciones:
Orrico F, López AC, Saliwonczyk D, Acosta C, Rodríguez-Grecco I, Mouro-Chanteloup I, Ostuni MA, Denicola A, Thomson L, Möller MN. The permeability of human red blood cell membranes to hydrogen peroxide is independent of aquaporins. J Biol Chem. 2022;298(1):101503. doi: 10.1016/j.jbc.2021.101503
Turell L, Möller MN, Orrico F, Randall LM, Steglich M, Villar S, Denicola A, Thomson L. Thiols in blood. Capítulo 25 en Redox Chemistry and Biology of Thiols. (B Álvarez, MA Comini, G Salinas y M Trujillo Eds., Academic Press, ELSEVIER), 2022, Pages 585-615. Doi: 10.1016/B978-0-323-90219-9.00025-X.
Demasi M, Augusto O, Bechara EJH, Bicev RN, Cerqueira FM, da Cunha FM, Denicola A, Gomes F, Miyamoto S, Netto LES, Randall LM, Stevani CV, Thomson L. Oxidative Modification of Proteins: From Damage to Catalysis, Signaling, and Beyond. Antioxid Redox Signal. 2021 Oct 20;35(12):1016-1080. doi: 10.1089/ars.2020.8176.
Möller MN, Cuevasanta E, Orrico F, Lopez AC, Thomson L, Denicola A. Diffusion and Transport of Reactive Species Across Cell Membranes. Adv Exp Med Biol. 2019; 1127:3-19. doi: 10.1007/978-3-030-11488-6_1.
Presentaciones en Eventos:
Orrico F, López AC, Saliwonczyk D, Acosta C, Rodríguez Grecco I , Mouro-Chanteloup I , Ostuni M , Thomson L. , MÖLLER MN. Permeability of phospholipid membranes and human red blood cell membranes to hydrogen peroxide. Presentado en SfRBM 28th Annual Conference (2021) – Society for Redox Biology and Medicine. Virtual. Resumen publicado en Free Rad Biol Med 2022, 180: 65. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2021.12.148
Lopez A , Möller, Mn , Thomson, L. Permeability of lipid membranes to hydrogen peroxide (2020). Presentado en la SfRBM 27th Annual Conference 2020, Publicado en Free Radical Biology and Medicine 159(1):27. Doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2020.10.082
Acosta, C , Saliwonczyk, D , Rodriguez I. , Denicola, A , Möller, MN , Thomson, L. Leukoreduction of red blood cell concentrates for transfusion. (2020) Presentado en la SfRBM 27th Annual Conference 2020, Publicado en Free Radical Biology and Medicine 159(1): 38. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2020.10.109
Orrico, F., Lopez A, Möller, MN , Denicola, A , Thomson, L. Permeability of Human Red Blood Cell Membranes to Hydrogen Peroxide (2020) Presentado en el 64th Annual Meeting of the Biophysical Society, San Diego, CA. Publicado en Biophysical Journal 118(3): 230. DOI: 10.1016/j.bpj.2019.11.1359.
Actividades docentes:
Entre el 7 de marzo y el 8 de abril de 2022 se dictó el curso “Glóbulos rojos del metabolismo oxidativo a la medicina transfusional”, dirigido a estudiantes de posgrado y organizado por Ana Denicola, Matías Möller, Ismael Rodríguez, Leonor Thomson en la Facultad de Ciencias y el Hospital de Clínicas, en formato híbrido, teóricos virtuales y prácticos presenciales.
Formación de Recursos Humanos
Formaciones Concluidas
Ana Clara López, defensa de Tesis de Maestría en Ciencias Biológicas el 11 de diciembre de 2020 con la tesis titulada “Permeabilidad del peróxido de hidrógeno en membranas”. Directores de Tesis Dres. Matías Möller y Leonor Thomson.
Formaciones en marcha
Florencia Orrico, estudiante de doctorado en Ciencias Biológicas PEDECIBA-Facultad de Ciencias, ingreso diciembre 2019, cuenta con beca de posgrado CAP.
Ana Clara López, estudiante de doctorado en Ciencias Biológicas PEDECIBA-Facultad de Ciencias, ingreso marzo 2022, cuenta con beca de posgrado CAP.
Nicolas Silva, estudiante de maestría en Ciencias Biológicas PEDECIBA-Facultad de Ciencias, comienzo mayo 2020, cuenta con beca de posgrado ANII.
Cecilia Acosta, maestría, PROINBIO-Escuela de Graduados, Facultad de Medicina, ingreso 2019.
Daniela Saliwonczyk, maestría, PROINBIO-Escuela de Graduados, Facultad de Medicina, ingreso 2018.
Eric Alarcón, Técnico en Hemoterapia y docente (G1) de la Tecnicatura en Hemoterapia de la Escuela Universitaria de Tecnología Médica, se incorporó recientemente al grupo y se encuentra inscripto al posgrado PROINBIO, contando con la dirección de los Dres. Gabriela Rivas y Matías Möller.
Marcel Donzé, es estudiante avanzado de la Licenciatura en Bioquímica y se encuentra desarrollando su tesina de graduación, con la dirección del Dr. Matías Möller y la codirección de la Lic. Florencia Orrico.
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