Poyecto FFCE2017
Con el trabajo de varios años hemos ido conformando un grupo de trabajo enfocado en la biología de los glóbulos rojos (GR) y en cómo extender la vida útil de los concentrados de GR para transfusión, conformado por la Dra. Leonor Thomson, Profesora Agregada de Enzimología del Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias, el Dr. Ismael Rodríguez, Profesor Titular de la Cátedra y Departamento de Medicina Transfusional, la Dra. Ana Denicola, Profesora Titular de Fisicoquímica Biológica del Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias y el Dr. Matías Möller, Profesor Adjunto de Fisicoquímica Biológica del Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias. A continuación se exponen los principales resultados de un proyecto culminado recientemente.
Permeabilidad de membrana y metabolización de peróxido en glóbulos rojos para transfusión
El principal sumidero de peróxido de hidrógeno en la vasculatura son los glóbulos rojos (GR), debido a una sólida defensa antioxidante y una alta permeabilidad de la membrana (Figura 1).
Figura 1 (Figura1_esquema). Se muestran los principales sistemas antioxidantes del glóbulo rojo involucrados en la descomposición del oxidante peróxido de hidrógeno (H2O2).
Respecto a estos sistemas de detoxificación, como primer resultado de este proyecto, demostramos el protagonismo de la peroxiredoxina-2 bajo condiciones fisiológicas, y la transición hacia la catalasa en condiciones experimentales habituales (Orrico et al, 2018) (Figura 2).
En condiciones fisiológicas (hematocrito 45%) Prx2 es responsable de la metabolización de cerca del 100% del H2O2 que se produce y/o ingresa al citosol, sin embargo, si la concentración del oxidante supera la concentración intracelular de la enzima y/o si el hematocrito es muy bajo la actividad catalasa predomina (Orrico et al 2018).
Ante la falta de datos sobre la permeabilidad de membrana (Pm) al H2O2 en GR decidimos profundizar en su análisis. El valor de Pm fue determinado (1.6 × 10-3 cm/s a 37º C), sugiriendo que la permeación de H2O2 podría darse tanto a través de la bicapa lipídica o de canales proteicos. También se estudió la permeabilidad de membranas formadas exclusivamente por lípidos (DOPC:POPG:Chol 4:1:5), y se encontraron valores de Pm para H2O2 muy similares a los de GR. En contraste, membranas compuestas por lípidos saturados mostraron una Pm 100 veces menor. Se estudió el rol de las acuaporinas, transportadores de membrana especializados en el transporte de agua y otros solutos no cargados que han sido involucrados en el transporte de H2O2 a través de las membranas de otras células. En el caso de los GR humanos la inhibición de las acuaporinas más abundantes no afectó el consumo del oxidante. Además, glóbulos rojos humanos carentes de acuaporinas mostraron la misma Pm que los normales, sugiriendo que el H2O2 entra al GR por difusión simple a través de la fracción lipídica, lo que imposibilitaría una potencial intervención farmacológica.
Figura 3. Permeabilidad de diferentes membranas al H2O2. A. La permeabilidad de la membrana de los glóbulos rojos humanos (hRBC) al H2O2 fue relativamente alta, pero similar a la de membranas compuestas por fosfolípidos insaturados y colesterol. B. La energía de activación del proceso fue relativamente baja en glóbulos rojos.
Figura 4. Permeabilidad relativa de las diferentes especies oxidantes. Las membranas son medianamente permeables al H2O2. Si bien en algunas células pueden difundir a través de acuaporinas 3 y 8, este no es el caso de los glóbulos rojos. Otras especies reactivas como el NO y el NO2 difunden 1000 a 10000 veces más rápido a través de la membrana, mientras que las especies aniónicas como el peroxinitrito y el superóxido utilizan canales iónicos, o difunden una vez protonados.
Respecto al almacenamiento de la sangre de banco, confirmamos la indemnidad de la actividad catalasa durante el almacenamiento y adicionamos la leucorreducción como variable, lo que nos permitió observar diferencias significativas en algunas de las variables exploradas, pero falta de protección en otras. Estos aspectos requieren de mayor investigación.
Recursos Humanos
Respecto a la formación de recursos humanos: la Lic. Florencia Orrico defendió el pasaje a doctorado en diciembre de 2019, habiendo contado con beca de maestría del contando con una beca de la Comisión Académica de Posgrados (CAP) de la UdelaR. La Lic. Orrico se encuentra desarrollando estudios de doctorado en el área del proyecto, contando con una beca de la CAP de la UdelaR.
Por su parte, la Mag. Ana Clara López obtuvo su título de maestría del PEDECIBA en diciembre de 2020, habiendo contado con beca del SNB del presente proyecto. La Magister López se encuentra desarrollando su proyecto de doctorado en un tema derivado del presente proyecto.
Además, desarrollan sus estudios de maestría PROINBIO-Facultad de Medicina en el área, las Dras. Cecilia Acosta y Daniela Saliwonczyk, ambas culminaron sus posgrados en Medicina Transfusional. El Técnico en Hemoterapia Nicolás Silva se sumó recientemente al proyecto, comenzando sus estudios de maestría en el marco del PEDECIBA, siendo becario del SNB.
Curso y Simposio
Se organizó el curso: “Development and evaluation of conservation solutions for the storage of RBC”, organizado por los Dres. Ana Denicola, Ismael Rodríguez, Matías Möller y Leonor Thomson. Este curso contó con la participación de docentes de Uruguay, Argentina, Brasil, Italia y Estados Unidos. Se desarrolló en la Facultad de Ciencias y el Hospital de Clínicas y contó con el apoyo económico del presente proyecto (FCE-2017-136043), del Centro Latinoamericano de Biotecnología (CABBIO, MEC-Uruguay), del Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA), de la Comisión Sectorial de Investigación Científica (CSIC) y del Espacio Interdisciplinario de la Universidad de la República.
Se organizó el simposio “Hemotherapy, from basic to bedside Montevideo 2019”, organizado por los Dres. Ana Denicola, Matías Möller, Ismael Rodríguez y Leonor Thomson, se llevó a cabo entre los días 30 de noviembre y 1 de diciembre en el piso 19 del Hospital de Clínicas Manuel Quintela, Av. Italia s/n. Contó con el apoyo de las instituciones nombradas en 4, además de la colaboración de las compañías Bioerix y Teksol. En el simposio se participaron los siguientes conferencistas: • Ismael Rodríguez, Departamento de Medicina Transfusional, Facultad de Medicina, Universidad de la República. Uruguay • Leonor Thomson, Instituto de Química Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay • Pablo Schwarzbaum. Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas “Prof. Alejandro C. Paladini”, Universidad de Buenos Aires, Argentina. • Marilene Demasi. Biology Division, Instituto Butantan, Sao Paulo, Brasil. • Lello Zolla. Molecular Biology and the Proteomics lab, Tuscia University of Viterbo, Italy. • Ana Denicola. Fisicoquímica Biológica, Instituto de Química Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay • Thelma Pertinhez. Department of Medicine and Surgery, University of Parma, Italy. • Susana Sánchez. Ciencias Químicas, Universidad de Concepción, Chile. • Leonel Malacrida. Departamento de Fisiopatología, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Uruguay. • Rakesh Patel. Department of Pathology, and the UAB Center for Free Radical Biology, Birmingham, Alabama, USA.
Presentaciones en Congresos
Los resultados de la investigación se presentaron en reuniones científicas nacionales (Congreso de Biociencias 2019 y Jornadas de la SBBM 2018) e internacionales (19th SFRRI Biennial Meeting, 2018, Lisboa, Portugal; XLVII SAB, 2018 La Plata, Argentina; Thiols: key players in the redox regulation of cellular functions, 2019, Montevideo, Uruguay; 64th Biophys. Soc. Meeting, 2020, San Diego, California; SfRBM 27th Annual Conference, 2020, Estados Unidos (en línea)) y
Publicaciones
Se publicaron los resultados de la investigación en revistas internacionales arbitradas:
• Möller MN, Rios N, Trujillo M, Radi R, Denicola A, Alvarez B. Detection and quantification of nitric oxide-derived oxidants in biological systems. J Biol Chem. 2019; 294(40):14776-14802. doi: 10.1074/jbc.REV119.006136.
• Möller MN, Cuevasanta E, Orrico F, Lopez AC, Thomson L, Denicola A. Diffusion and Transport of Reactive Species Across Cell Membranes. Adv Exp Med Biol. 2019; 1127:3-19. doi: 10.1007/978-3-030-11488-6_1.
• Orrico F, Möller MN, Cassina A, Denicola A, Thomson L. Kinetic and stoichiometric constraints determine the pathway of H2O2 consumption by red blood cells. Free Radic Biol Med. 2018; 121:231-239. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2018.05.006.
• Möller MN, Denicola A. Diffusion of nitric oxide and oxygen in lipoproteins and membranes studied by pyrene fluorescence quenching. Free Radic Biol Med. 2018; 128:137-143. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2018.04.553 8.
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